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微量分光光度计主要用于核酸及蛋白质的浓度测定和纯度评估。然而,在实际应用中,经常会出现核酸较容易被准确测量,而蛋白质样品的浓度测量偏差较大的情况。很多用户也困惑于此,同样是基于紫外吸收的检测,为何两种样品的检测性能会有差异呢?
坊间也时常出现一些说法:微量只能用于测核酸,而蛋白测不准。如果真是这样的话,那么设备的使用率就会大打折扣了。传闻是不可轻信的,我们还是需要了解原因,然后才能找出解决方案。
先上一组数据看看
重复性和稳定性是评判设备性能的好方式,这三台基础型Nanophotometer® N50T机型在正确的操作下,对较低浓度和较高浓度样品的测量,都能够得到一致的结果,CV<0.4%。如果设备性能都如此,那前面所述的问题就不存在了。
普遍问题:蛋白样品表面张力的影响
蛋白质样品,相较于核酸而言,更容易出现表面张力降低的情况。因此,如果你的微量分光光度计是采用样品拉伸原理的,即形成液柱的方法,对于一些样品而言,是难以进行测量的,这可能是造成测量准确性和重复性不好的大原因。
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影响因素一:温度和挥发
通常来说,液体的温度升高,由于分子间引力减弱,表面张力会随之降低。这也解释了为何低温保存的核酸样品,张力较大,更易形成液柱。在夏天实验环境较热,或者制药用户的恒温恒湿实验室,温度是相对较高的,张力会随之下降。
等一下,不是有空调吗?空调产生的气流会大幅增加微量液体的挥发,暴露在空气中的液柱易受到影响,对测量重复性影响较大。结果就是:房间热易挥发,冷风吹也易挥发。
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影响因素二:盐
无机盐作为一种非表面活性剂,具有水合作用,趋向于把水分子拖入水中,因此会增大表面张力,反之亦然。因此,脱盐或低盐的样品,表面张力会降低,常见于蛋白纯化的流程。例如在进行蛋白质结构分析或质谱分析时,样品需经过脱盐处理,这样的样品在进行浓度测量时,并不容易形成液柱。
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影响因素三:表面活性剂
蛋白提取过程中经常使用的表面活性剂(清洁剂),如SDS、Triton X100,以及在发酵过程中加入的消泡剂等成份,会大幅降低样品的表面张力(想想看,连维持泡沫的张力都没有了),这些物质常会残留在样本中,难以完全去除。因此,在工艺过程中测量蛋白样品,是一项挑战。
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影响因素四:固液接触表面
当使用移液器将微量样品加载到点样台后,会出现液体与固体的接触表面,点样台表面的亲水/疏水性质会影响液体的表面张力。因此,使用拉伸法的主流品牌微量分光光度计,点样台表面具有疏水性涂层,会增大液体的张力。但是,随着使用损耗,涂层会逐渐消耗,需要定期使用试剂进行维护和再生。在正确的维护之后,这一影响因素也随之消失,但也增加了维护成本,而大多数用户并不知道这一点。
这么麻烦?我还测不测了!
我们换个思维,如果一台微量分光光度计的测量原理,并不依赖于液体的表面张力呢?Implen就可以,采用样品压缩技术的Nanophotometer®检测时无需形成液柱,而是将液滴压缩为很薄的液膜。因此,无论核酸、蛋白,都可以使用Nanophotometer®轻松测量。而封闭式的检测环境,也很好的保护了样品免受挥发影响。
无论是纯化蛋白、总蛋白、结合蛋白、还是肽段样品,Nanophotometer®都有丰富的APP程序和方法学应用,以及我们的技术团队提供的支持,使您在蛋白浓度测量中遇到的问题迎刃而解。