新闻中心
超微量分光光度计是核酸及蛋白质定量的基础仪器，此外还具备全波长扫描等丰富的功能。在日常实验中，核酸定量是最常规的应用，基于紫外吸收法的核酸定量设置简单，仅需要选择正确的样本种类，即可得到浓度及纯度比值。而对于蛋白质定量来说，由于样本种类、溶剂成分、方法学适用性等多种因素影响，相对复杂一下，以致不少用户的测量结果与真值偏差很大。本文针对蛋白质定量，讨论了一些对结果影响较大的常见问题。
方法学适用性是最重要的
以Nanophotometer® NP80机型为例，其本身具备7种蛋白质定量方法，包括UV法、多种标准曲线法、公式法等。多样化的方法意味着适用性不尽相同。例如，已知消光系数的纯化蛋白，使用UV280法是直接且准确的；一些小分子蛋白无明显UV280吸收峰的，可使用A205肽键吸收法进行测量；含RIPA成分的裂解液中的总蛋白，应使用标准曲线法测量；体系具有其他UV280吸收的成分的混合物，可使用公式法进行测量。如果使用的方法不对，则会受到非常大的干扰，得到误差很大的结果，对后续实验结果造成严重影响。
总结需要考量的因素：
1，是否有典型吸收峰?
2，是否有干扰?
3，需要测量相对或大概浓度，还是准确的浓度?
吸光值和浓度是两码事
紫外UV280法，是基于朗伯-比尔定律进行定量的，吸光值=消光系数×浓度×光程。光程是仪器在设计时就定好的，是已知量（假设仪器光程没有漂移），因此只需要考虑消光系数。不同蛋白质由于典型氨基酸-酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸含量不同，因此消光系数也差别很大，如BSA为0.667，抗体类一般为1.3-1.7之间。仪器测量的吸光值根据蛋白种类不同，可以计算为不同的浓度且差别较大。因此，应尽可能的查询纯化蛋白质的准确消光系数，或者降低准确性预期。如未知氨基酸序列的样本，可根据大概结构使用近似的蛋白质的消光系数进行估算。也可使用OD1（即1OD-1mg/ml）进行估算或测量相对浓度。
注意光谱曲线的异常
单看A280吸光值和浓度值，其实是无法判断数据可靠性的，需要结合吸收光谱曲线。超微量分光光度计一般都是全波长的，可以获得光谱曲线（一些使用滤光片的设备是单波长的，没有光谱曲线）。当光谱曲线出现明显异常时，需要找出的问题和评估影响。如有颗粒物和沉淀的样本，将导致浊度散射，往往吸光值将大幅增加，浓度结果被高估，可使用背景校正功能进行修正（单波长背景修正或多波长外推）。曲线出现明显拐点，说明有共吸收物质影响，需要评估影响因子。通过曲线评估有助于对测量结果进行判断。
图：典型的浊度散射曲线，可能由于沉淀或颗粒物导致
图：含有RIPA的样本，由于临近的吸收峰重叠导致曲线具有拐点，并伴随有轻微散射
另外，即使方法适用，在使用不同方法进行蛋白浓度测量时，结果会有一些差异，如BCA和UV280法对分子量较大的非变性球蛋白进行定量时，由于空间位阻，BCA的还原性降低，而UV280紫外吸收并不受影响，导致BCA的测值可能偏低。因此，对于测量结果应科学评估，并考虑多种潜在因素。更好的使用您的超微量分光光度计，专业的问题解答请关注德国Implen。
