近日，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所王晓钧团队在《PLoS Pathogens》杂志刊载了题为 「Selective usage of ANP32 proteins by influenza B virus polymerase: Implications in determination of host range」的文章。该文章系统性地揭示了 B 型流感病毒感染的种间限制机制，发现宿主 ANP32A&B 蛋白是决定 B 型流感病毒聚合酶活性的须关键因子。

甲型流感病毒（IAV）和乙型流感病毒（IBV）属于正粘病毒科。禽类作为 IAV 的重要宿主，经常将 IAV 跨物种传播给哺乳动物。而 IBV 与 IAV 复制机制类似且受体相同，却少有禽类自然感染 IBV 的报道，这说明 IBV 在禽类体内无法复制，但具体机制尚不明确。

图 2   乙型流感病毒结构示意图

前期研究已经证明，宿主 ANP32A&B 蛋白在  IAV 聚合酶活性中起到关键性作用，那么 ANP32 蛋白是否在 IBV 的复制中也具有类似的功能呢？不同物种的 ANP32 蛋白是否为 IBV 提供不同的支持？

研究团队构建出不同的细胞系，利用聚合酶双荧光报告系统等技术，获得重大发现，其中两点尤为突出：

1.ANP32A、ANP32B 对于 IBV 的复制起主要作用，ANP32E 的作用相对有限；

2.哺乳动物 ANP32A&B 蛋白可以完全支持 IBV 聚合酶复制，而禽类 ANP32A 由于有 33 个氨基酸的插入以及禽类 ANP32B 由于 129/130 位点的突变，导致禽类 ANP32A&B 均无法支持 IBV 的复制。

为进一步探索不同物种 ANP32 蛋白支持 IBV 聚合酶活性差异的分子机制，该研究利用 Co-IP，以及基于 Biacore 的表面等离子共振 SPR 等技术进行相关检测。

Co-IP 实验结果显示： huANP32A 和  chANP32A 对于 IBV 聚合酶具有相似的结合能力，但无法给出定量的结合差异分析。为了解决这个问题，研究人员使用 Biacore  对 IBV 聚合酶与 ANP32 蛋白进行动力学/亲和力表征。

研究人员使用 CM5 芯片氨基偶联 Anti-His 抗体自制 Anti-His 捕获芯片，随后流经含有 His-IBV 聚合酶的细胞裂解液，捕获 His-IBV 聚合酶。然后将 ANP32 蛋白稀释到一系列浓度作为流动相，使用 Biacore T200 对聚合酶与 ANP32 蛋白进行动力学/亲和力表征。

实验结果表明：与 Co-IP 结果一致，huANP32A，chANP32A 和 huANP32A + 33 在 0.15625-5μM 的浓度下均能与病毒聚合酶结合（图 4A – 4C）。相反，huANP32A_165T 几乎不与聚合酶结合（图 4D）。在另一个仅将两个聚合酶亚基（PA 和 PB1）固定在 CM5 芯片上的对照实验中，在 huANP32A 和病毒聚合酶亚基之间未检测到特异性亲和力（图 4E）。

通过 Biacore 分析计算得出 huANP32A，chANP32A 和 huANP32A+ 33 的解离平衡常数（KD）有着显著差异。huANP32A 与 IBV 聚合酶结合，KD = 0.05418μM，几乎比 chANP32A 低 3 倍。插入 33 个氨基酸的 huANP32A 和聚合酶结合的 KD 值也从 0.05418μM 增加到 0.1013μM（图 4F）。尽管 huANP32A，chANP32A 和 huANP32A + 33 具有相似的解离速率常数（kd），但结合速率常数（ka）却截然不同。huANP32A 与 His-IBV 聚合酶结合的 ka 值是其他两种蛋白质的 ka 值的两倍。

该结果表明，与 ChANP32A 相比，huANP32A 对 IBV 聚合酶具有更强的结合亲和力，并且 33 个氨基酸的插入降低了 ANP32A 与 IBV 聚合酶的结合亲和力。

图 4 IVB 聚合酶与 ANP32 蛋白互作 Biacore 结果

该研究揭示了哺乳动物 ANP32 家族蛋白是支持 IBV 复制的关键宿主蛋白，并明确了禽类 ANP32 蛋白无法支持病毒聚合酶活性的分子机制（图 5）。对理解 IBV 聚合酶功能、作用机理和宿主范围决定因素具有重要意义，同时可为抗 IBV 药物靶点设计和跨物种传播的防控提供理论依据。

图 5 IAV 和 IBV 聚合酶对 ANP32 蛋白的选择性使用及其分子基础

纵观全文，Biacore 的技术优势清晰易见

1、Biacore 区分出不同物种、不同氨基酸结构的同源蛋白与 IBV 聚合酶相互作用的细微差异，这是 Co-IP 等同类技术所不具备的，充分体现出 Biacore的分辨率。

2、Biacore 互作信息，帮助研究人员从 KD、ka、kd 等方向表征分子相互作用，定量地阐释不同分子之间相互作用的异同点，从而帮助科研人员好的阐明相关的分子机制。

3、利用 Biacore 可以直接捕获粗样品中的目的蛋白，并进行亲和力动力学的表征。这这篇文章中，研究人员利用 Anti-His 捕获芯片，能够从细胞裂解液中直接捕获 His-IBV 聚合酶，并检测其与 ANP32 蛋白的互作。这样只需要纯化一种蛋白即可进行的亲和力动力学表征，降低了样品准备时间与难度。

自 1990 年上市自今，Biacore 经过 30 年的发展，已经成为分子互作检测的「金标准」，广泛应用到基础科研与药物开发的多个领域，累计发表的文章已经过四万篇，过 80% 的上市抗体药物在研发、申报与生产中都使用了 Biacore。